AHEAD可以實(shí)現(xiàn)抗體在酵母?jìng)鞔^程中的自突變，在短短兩周內(nèi)實(shí)現(xiàn)親和力成熟。此技術(shù)的進(jìn)一步成熟以及商業(yè)化也許可以促進(jìn)抗體藥物發(fā)現(xiàn)進(jìn)程，加速抗體研發(fā)效率降低實(shí)驗(yàn)成本。

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技術(shù)解讀

構(gòu)建酵母超突變系統(tǒng)

    增加獨(dú)立于正常DNA復(fù)制體系的OrthoRep模塊，其中關(guān)鍵在于正交易錯(cuò)DNA聚合酶會(huì)復(fù)制一個(gè)特殊的細(xì)胞質(zhì)質(zhì)粒P1，其突變率比正常的DNA聚合酶高100000倍。當(dāng)納米抗體片段在P1上編碼時(shí)會(huì)隨著酵母的不斷傳代穩(wěn)定產(chǎn)生突變。這套胞內(nèi)超突變系統(tǒng)可以在短時(shí)間內(nèi)建立超大文庫。

構(gòu)建酵母展示篩選系統(tǒng)

    將納米抗體基因放在Aga2融合多肽的N末端，之后分泌表達(dá)并展示在酵母表面。注：作者通過引入新的P1載體的特異性啟動(dòng)子，使用更強(qiáng)的分泌前導(dǎo)并在納米抗體下游加入一個(gè)多聚腺苷，將納米抗體的表面展示水平提高了約25倍。整體的篩選流程只需要在酵母培養(yǎng)與FACS之間循環(huán)即可進(jìn)行快速篩選。

應(yīng)用案例

使用AHEAD進(jìn)化SARS-CoV-2抗體

    如上圖，經(jīng)過AHEAD 3~8個(gè)循環(huán)后，8個(gè)弱親和力的抗體均進(jìn)化得到了更高親和力的多突變納米抗體，最高提升約580倍，得到最高親和力Kd=0.72nM。經(jīng)過中和SARS-CoV-2假病毒實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其中大多數(shù)具有優(yōu)秀的病毒中和能力，最大抑制濃度IC50=0.52nM。

優(yōu)點(diǎn)

1. 相對(duì)于傳統(tǒng)抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)與篩選技術(shù)，AHEAD在效率與成本上體現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。

2.超高的庫容量可以對(duì)更大的序列空間進(jìn)行搜索。

3.可以將一個(gè)文庫作為起始進(jìn)行突變并且進(jìn)行高通量篩選，從而探索更多的進(jìn)化路線。

缺點(diǎn)

1.可能會(huì)在載體上非抗體部分引入突變從而降低篩選效率。

2.不能在特定的CDR區(qū)進(jìn)行突變，雖然可以發(fā)現(xiàn)在非CDR區(qū)的部分突變組合可以提高親和力，但同時(shí)也會(huì)增加可成藥性的風(fēng)險(xiǎn)。

思考

1.也許這套系統(tǒng)會(huì)更加適合其他蛋白質(zhì)的定向進(jìn)化，如酶改造、細(xì)胞因子改造、de novo小蛋白親和力成熟等。

2.關(guān)于納米抗體篩選中的成藥性風(fēng)險(xiǎn)也許可以結(jié)合AI模型來解決，當(dāng)然科學(xué)且嚴(yán)謹(jǐn)?shù)呐R床前實(shí)驗(yàn)才是檢驗(yàn)真理的唯一標(biāo)準(zhǔn)。

3.這套系統(tǒng)的超突變方法與高通量篩選方法還有進(jìn)一步優(yōu)化的空間

    在藥物發(fā)現(xiàn)的過程中，各種先進(jìn)有效的手段被用來探索更多的可能性，我們堅(jiān)信這些新技術(shù)的融合會(huì)徹底并深刻地改變藥物發(fā)現(xiàn)的進(jìn)程。未來AIBIOROBOTS會(huì)專注在AI、生物藥、自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域分享更多有趣的內(nèi)容。關(guān)于AHEAD后續(xù)會(huì)有進(jìn)一步的硬核技術(shù)分享。